細胞自噬在牙周炎中的作用與機制

2020-3-5 14:03  來源:華西口腔醫學雜志
作者:莫龍義 賈小玥 劉程程 周學東 徐欣 閱讀量:1538

    牙周炎是由牙菌斑生物膜引起的牙周支持組織的感染性疾病,可導致牙齦上皮、牙周結締組織和牙槽骨的破壞。細菌感染過程中,機體啟動免疫炎癥反應來清除感染源并啟動組織修復,整個過程涉及一系列炎癥和骨代謝相關信號轉導通路的激活。然而過度的免疫炎癥反應往往導致疾病的加重。最近的研究表明,在牙周炎的發生發展中,細胞自噬可能參與調控牙周病原菌感染,宿主免疫炎癥反應和牙槽骨代謝等過程。本文就細胞自噬與牙周炎的關系作一綜述。

    1. 細胞自噬及其相關通路

    自噬是一種在進化上高度保守的溶酶體降解途徑,是一個將細胞內變性受損或衰老的蛋白質、細胞器和侵入機體的微生物等,運輸到溶酶體進行消化降解的過程。廣義的自噬包括4種形式:微自噬、巨自噬、分子伴侶介導的自噬和非典型自噬。其中巨自噬(以下稱自噬)是最主要的自噬形式。與其他的胞內降解途徑不同,自噬的核心機制是通過形成一個具有雙層膜包裹的囊泡——自噬體,隔離部分細胞質、細胞內蛋白質、細胞器或微生物,并通過與溶酶體融合形成自噬溶酶體以降解其所包裹的內容物。

    自噬形成的過程可分為誘導階段、起始階段、延長階段和成熟降解階段。整個自噬過程主要受雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)和Beclin1復合體調節。其中mTORC1通過調控下游靶點4E-BP1和核糖體蛋白S6激酶的磷酸化來調控mRNA的翻譯,從而控制細胞自噬。

    當雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受抑制時,mTOR底物復合物從細胞基質轉移到內質網,募集Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-OH激酶復合物[class Ⅲ phosphatidylinositol-3-OH kinase complex,PI(3)K],從而使得下游VSP34、VSP15、Beclin1和ATG14轉移到內質網,在下游蛋白作用下內質網形成一個類似Ω的結構,促進自噬體的形成。而Beclin1通過調節脂質激酶VSP34,促進beclin1-VSP34-VSP15復合物,進而調節自噬活性。

    2. 細胞自噬與牙周病原菌感染

    作為細胞的病原菌感受器,自噬缺陷會引起細胞抵御感染的能力降低。病原菌通過各種機制逃避和抑制細胞自噬,從而生存、增殖和致病。例如,在克羅恩病發生發展過程中,自噬蛋白Atg16L1、免疫相關GTP酶家族M蛋白(immunity-related GTPase family M protein,IRGM)和核苷酸結合寡聚化結構域2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)發揮了重要的抗菌作用。

    在多數病原菌感染的條件下,自噬能促進感染細胞對病原體和毒素的清除,抵抗細菌的入侵。而某些牙周細菌可逃避自噬分子的識別,干擾自噬體形成,阻止自噬體和溶酶體融合,甚至在自噬體中生存和增殖。Belanger等研究發現,牙周炎重要可疑致病菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis)可以激活細胞自噬,并進入自噬小泡,躲避宿主的免疫炎癥反應。在自噬小泡中,P. gingivalis還可利用其中的蛋白質等物質為自身生存提供能量。

    通過3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素抑制細胞自噬后,內化于自噬小泡的P. gingivalis將被呈遞給自噬溶酶體,降解清除。Takeuchi等研究也發現,自噬抑制劑渥曼青霉素可減少牙齦上皮細胞中P. gingivalis的數量。這表明P. gingivalis在宿主內皮細胞的生存依賴于自噬的激活,但具體機制尚不清楚。Cho等研究發現,P. gingivalis感染癌癥細胞可以誘導細胞自噬,抑制細胞增殖。

    Blasi等發現LC3和MREG在重度牙周炎患者牙齦上皮細胞中成共定位分布,而輕度牙周炎患者沒有發現,因而推測P. gingivalis感染可能抑制了正常的自噬過程。并且P. gingivalis侵入主動脈內皮細胞后主要進入吞噬體/溶酶體途徑,只少量進入自噬途徑。而P. gingivalis侵人臍靜脈內皮細胞后不但可以逃脫宿主的清除,還能夠將感染傳染到相鄰細胞。從而推測可能會抑制自噬體與溶酶體融合或者改變正常的自噬轉運從而影響自噬溶酶體的形成。

    Bullon等研究發現,牙周炎患者外周血單核細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生與微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP-LC3)基因的表達呈正相關。體外實驗研究也發現內毒素刺激人牙齦上皮細胞后,自噬相關蛋白12(autophagy-related protein12,ATG12)在基因和蛋白水平均表達上調,同時LC-3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例升高。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸一起處理人牙齦上皮細胞后,則不會引起ATG12和LC-3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的變化。以上的研究結果提示,牙周炎發生發展過程中自噬失調可能是由過量ROS的形成誘導的。

    研究表明,牙齦成纖維細胞中P.gingivalis產生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可通過ROS誘發自噬。同時Levine等研究發現,牙周炎患者相較于健康人群的外周血單核細胞中自噬基因表達量更高,線粒體中ROS更多。當用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理內毒素感染的人牙齦上皮細胞時,自噬被抑制。細胞存活率降低,凋亡細胞的比例增加,這表明自噬在牙周炎中的保護作用。然而,Tsuda等的研究則得出了相反的結果,口腔細菌,尤其是革蘭陰性菌產生的丁酸鹽刺激牙齦上皮細胞Ca9-22時,LC3蛋白表達增多,表明自噬增強。當用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后可緩解丁酸鹽誘導的牙齦上皮細胞Ca9-22的死亡。這表明了自噬在牙周炎中的病理作用。

    綜上,目前研究雖提示自噬與牙周炎相關,但尚無充分的證據證實自噬在牙周炎中的作用是保護作用還是病理作用。因此,深入探討細胞自噬在牙周病原菌感染中的作用機制,有助于進一步揭示牙周病原菌感染過程,也為通過調控細胞自噬預防和治療牙周炎的發生、發展提供新的思路和方法。

    3. 細胞自噬與免疫炎癥反應

    牙周炎是多菌種感染引起的慢性炎癥性疾病。一方面,牙周致病菌的多種毒力因子可直接參與牙周組織的破壞。另一方面,大多數牙周組織破壞是由宿主對感染的持續性免疫炎癥反應引起。自噬誘導及先天性免疫反應的激活被認為是細胞抵御牙周病原菌感染的第一道防線。牙周致病菌侵入牙周組織后,機體通過吞噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞表面的Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)和NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)等模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別病原微生物的病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)和細胞損傷后釋放的損傷相關分子模式(damage-associated molecularpatterns,DAMPs),激活宿主的免疫炎癥反應,誘發細胞自噬。同時細胞自噬有助于抑制炎癥反應以維持細胞內環境的穩態。

    3.1 先天免疫模式識別受體與自噬

    作為機體抵御病原微生物的第一道防線,天然免疫可誘導機體對入侵的病原微生物做出快速的反應,PRRs識別病原微生物是天然免疫的一個重要因素。自噬被認為是一種新的宿主天然免疫途徑。El-Awady等研究表明,自噬在促進天然免疫和控制細菌感染中具有重要作用,而免疫細胞類型,微生物的種類以及PRRs的參與是自噬清除病原微生物的關鍵。Munz的研究也顯示自噬和PRRs可以相互調節以抵御病原微生物的入侵。TLRs是參與天然免疫的一類重要蛋白質分子,通過識別病原體誘導天然免疫和炎癥反應。TLRs是最早發現的PRR,也是最早被證實參與自噬的。腫瘤壞死因子受體相關分子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6)是TLR4信號通路中的關鍵分子,可以通過招募Beclin-1,誘導其泛素化,而參與自噬的起始。同時泛素化的TRAF6也可以激活UNC-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)促進自噬。

    Delgado等研究表明,TLR3、TLR7、TLR8和TLR9可識別病毒產物從而激活細胞自噬。同時,自噬也可調節TLRs。最早在大鼠漿細胞樣樹突狀細胞中發現自噬體可以激活內膜上的TLR,誘導1型干擾素的產生,還可促進適應性免疫,抵御微生物感染。TLR2、TLR4與牙周炎的發生密切相關。

    Sumedha等通過免疫組化的方法發現牙周病患者中TLR2的表達要明顯高于健康人,TLR2信號通路可介導P.gingivalis所誘導的牙槽骨的吸收從而引起牙周炎,而TLT4在炎癥的早期促進白細胞介素(interleukin,IL)1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的表達誘發炎癥。研究發現敲除了TLR4基因的小鼠用P. gingivalis處理后沒有出現牙槽骨吸收,而正常對照組小鼠出現明顯的牙槽骨吸收,這表明TLR4是P. gingivalis誘導牙周炎發生所必須的。因此,推測自噬可能通過調節TLR2和TLR4而影響牙周炎的發生。

    在激活先天免疫反應中,PAMPs和DAMPs可通過與TLR或NLR相互作用誘發自噬,同時自噬也可負向調控TLR信號。Morimoto等發現牙周病患者的齦溝液中高遷移率族蛋白B1濃度更高,其可與TLR4結合引起炎癥反應,也可與Beclin1作用在自噬的調控中發揮重要作用。

    3.2 自噬調控免疫炎癥反應

    自噬和炎癥反應是細胞應對外源性壓力的兩種重要途徑。自噬在炎癥反應中扮演著重要角色,自噬可影響炎性細胞的生成,維持炎性細胞的穩態,以及保持炎性細胞的存活,包括巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞。自噬可影響這些細胞的轉錄、加工以及細胞因子的釋放,同時這一過程也受細胞因子的調控。目前越來越多的證據表明細胞自噬在炎癥和免疫反應的發生發展中具有重要的作用。

    細胞自噬不僅可促進細胞響應外界刺激,也可與自噬相關蛋白和免疫信號相互作用。目前自噬依賴性機制已經應用于多種炎性疾病發病機制的研究中,比如傳染病、囊胞性纖維癥、肺動脈高血壓和牙周炎等。Kook等研究發現,P. gingivalis和LPS可以誘導兔顱骨炎癥反應,而自噬可以通過抑制巨噬細胞炎癥因子的產生從而減輕骨炎癥反應。此外,Kim等的研究也發現,種植體周圍牙周軟組織的愈合也和自噬有關。內質網應激通過p38MAPK通路誘導人牙齦成纖維細胞死亡和自噬。

    自噬可通過TLRs和NLRs調節牙周先天免疫應答,如阻礙細胞因子的分泌抑制牙周免疫應答。首先,細胞自噬能減少IL-1β和IL-18的分泌,抑制炎癥反應。構建動物模型發現,相較于對照組,小鼠缺乏LC3B會產生更多的半胱天冬酶-1依賴型蛋白。在LC3B缺乏的巨噬細胞中也發現了相似的現象。其次,細胞自噬可負向調控IL-1α的分泌。Castillo等發現缺乏Atg5能通過活性氧-鈣蛋白酶(ROScalpain)炎性通路產生更多的IL-1α。因此,細胞自噬可能通過調節炎性小體依賴或非炎性小體依賴的炎癥反應來調節牙周炎炎性反應。

    4. 細胞自噬與牙槽骨代謝

    牙槽骨吸收是牙周炎最重要的表型之一,也是導致牙周炎患者最終牙齒脫落最根本的原因。自噬不僅誘導破骨細胞增殖,而且還在實驗性關節炎模型中刺激破骨細胞介導的骨吸收。相反,通過遺傳或藥物操作在單核細胞中抑制自噬,減少破骨細胞發生,并強烈地防止了結構損傷。此外,DeSelm等發現Atg5、Atg7、Atg4B和LC3等重要Atg蛋白顯著調節破骨細胞功能。

    破骨細胞所介導的骨骼吸收過程類似于溶酶體的形成過程,在骨組織受損邊緣,破骨細胞會分泌一種可以與溶酶體融合的基質降解因子。隨后將這些分子釋放到骨質膜的一個區域,導致骨吸收。這些自噬蛋白不僅調節溶酶體與吞噬體的融合,還有助于調節與分泌溶酶體的融合和破骨細胞的骨吸收。此外,邊界形成需Rab7和其他蛋白質,并且Rab7的定位化依賴于Atg5。此外,Atg7和Atg4B/LC3還有助于將Rab7募集到受破壞的邊緣,表明自噬蛋白對這種邊緣和骨吸收是重要的。

    4.1 自噬與破骨細胞

    破骨細胞是由骨髓干細胞分化的多核細胞(multinational corporations,MNCs)。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和核因子κB受體活化因子受體(receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand,RANKL)調控破骨細胞的分化。越來越多的證據顯示,自噬相關蛋白可調控破骨細胞引起的骨吸收。破骨細胞是通過直接分泌溶酶體酶類和有機酸到細胞間質而引起骨吸收。而自噬體可通過Atg5、Atg7、Atg4B/LC3這些自噬蛋白調節溶酶體與自噬體融合。

    DeSelm等的研究也發現,敲除Atg5和Atg7都會抑制LC3Ⅰ向LC3 Ⅱ轉化,減弱破骨細胞骨吸收能力。其中自噬蛋白通過指導溶酶體與質膜融合而參與溶酶體內容物的極化分泌進入細胞外間隙。Owen等也發現,在體內生成大量破骨細胞會募集大量的P62,但會減少Atg5、Atg7和LC3-Ⅱ的表達,并減少細胞自噬。Whitehouse等研究也發現,在小鼠動物模型中,阻斷細胞自噬選擇性受體Nbr1的基因后,會引起破骨細胞的數量及活性的增加,在破骨細胞中,無論是在體內還是體外,自噬關鍵蛋白對于褶皺緣的形成,分泌的功能以及骨吸收都具有重要作用。

    4.2 自噬與成骨細胞

    成骨細胞在骨形成細胞中具有重要作用,在骨形成過程中,一部分分化為骨細胞,一部分凋亡。細胞自噬一開始被認為是骨細胞適應環境壓力的主要生存機制,但Onal等的研究發現敲除Atg7的條件等位基因會導致6個月大的雄性和雌性小鼠的骨量減少,同時成骨細胞和破骨細胞數都減少。Whitehouse等的研究發現,敲除大鼠自噬運送受體NBR1基因后,其骨密度和骨含量隨年齡增長而升高;自噬誘導劑雷帕霉素處理成骨細胞后,其分化水平顯著提升。

    Pantovic等的研究也發現,通過基因或者藥物處理的方式抑制細胞自噬都會阻礙間充質干細胞分化成成骨細胞。Nollet等發現自噬缺陷的成骨細胞表現出氧刺激增加,分泌核因子κB1(TNFSF11/RANKL)受體激活子,生成破骨細胞,增強骨吸收。在體內,自噬缺陷小鼠的骨小梁減少了50%。但Lai等有不一樣的觀點,他們發現自噬可以負性調節成骨細胞的凋亡。辛伐他丁可能通過促進自噬,抑制成骨細胞凋亡減緩根尖周炎癥的炎癥。

    4.3 自噬與骨細胞

    骨細胞是成骨細胞的終末分化細胞,在骨基質內處于乏氧和營養缺乏的狀態,具有比成骨細胞更高水平的自噬活動。自噬在維持機體骨代謝平衡中具有重要的作用,一些自噬相關蛋白在骨細胞的調控中也起到關鍵性作用。研究發現自噬對骨細胞分化有重要作用,骨細胞膜上LC3蛋白表達量顯著高于成骨細胞,自噬水平隨骨細胞分化程度增高而增高。Zhao等發現,敲除大鼠骨細胞Atg7基因可以抑制細胞自噬,其骨皮質密度顯著降低,進一步證實自噬與骨細胞分化密切相關。小鼠骨細胞表面LC3的表達量高于成骨細胞,骨細胞通過調節自噬流以對外界環境作出快速應答。

    Shapiro等在佩吉特病發病機制的探究中,發現與自噬誘導骨吸收有關,減少成骨。研究發現在成長階段,存在軟骨細胞自噬,而給老鼠用自噬激活子雷帕霉素處理后可修復長骨的生長。Carames等也發現隨著年齡的增加,小鼠和人膝關節軟骨的ULK1、MAP1LC3和BECN1蛋白的表達會減少,這些自噬關鍵調節子的減少是通過增加細胞凋亡實現的。

    綜上所述,如何控制牙周炎性破壞并促進牙周組織再生是治療牙周炎的關鍵。細胞自噬可以增強機體對病原體抵御感染的能力,有助于抑制炎癥反應,以維持細胞內環境穩態,并可通過調節破骨細胞和成骨細胞分化,調控牙槽骨炎性骨吸收過程。自噬對牙周各類骨代謝相關細胞的作用機制尚處于探索階段,其如何對牙周炎產生影響仍待進一步研究。越來越多的研究提示免疫系統調控與細胞自噬在牙周炎中具有重要作用,為研究牙周炎的發生、發展及臨床防治提供了新的思路與潛在途徑。

編輯: 陸美鳳

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