糞腸球菌在牙髓根尖周病中致病機制及抗菌治療的研究進展

2020-3-5 14:03  來源:口腔疾病防治
作者:李瑩雪 王雨霏 張凌琳 閱讀量:984

    糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)與牙髓根尖周病的關系已有多年的研究歷史,與未經根管治療的原發性根管感染相比,E.faecalis與根管治療失敗后的持續或繼發性根管感染之間呈現更高的相關性。R??as等發現持續性根管感染病例和原發性根管感染病例中E.faecalis的檢出率分別為67%和18%,E.faecalis存在于前者的概率是其在后者的9.1倍。雖然E.faecalis的檢出率或數量構成比在不同研究中存在較大差異,其主要致病菌的地位近年來也受到質疑,但仍有學者報道,E.faecalis在持續或繼發性根管感染中的檢出率高達80%以上,數量構成比可達99.8%。

    此外,有系統性回顧研究表明不論是采用傳統的細菌培養技術還是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)進行檢測,E.faecalis與持續或繼發性根管感染之間的相關性始終比其與原發性根管感染之間更高。由此可見,E.faecalis與根管治療失敗密切關聯,探索E.faecalis在牙髓根尖周病中的致病機制有著重要的臨床指導意義。本文就E.faecalis在牙髓根尖周病中的致病機制及對其治療的研究進展作一綜述。

    1.糞腸球菌的致病機制

    E.faecalis能夠造成牙髓及根尖周組織的損傷,但具體致病機制尚未明了。近年來通過對其致病能力及相關毒力因子展開的探索,取得了一些E.faecalis致病機制的新進展。

    1.1糞腸球菌的致病能力

    1.1.1單獨形成生物膜的能力

    E.faecalis能夠獨自在根管內形成生物膜而無需其他微生物協助,E.faecalis生物膜不僅存在于主根管內壁,還可蔓延至側副根管、根尖分叉、根管峽部等細小的不規則部位。Al-Ahmad等用6種E.faecalis臨床株證實E.faecalis具有單獨形成生物膜的能力,且產量較高。

    此外,Distel等用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)和激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察發現在Ca(OH)2封藥77d后的人離體牙根管內有成熟的E.faecalis生物膜呈柵欄狀黏附于根管壁,聚集的菌落呈蘑菇狀突向根管腔。生物膜的形成有利于E.faecalis在含有抗菌制劑、高堿性以及缺乏營養的惡劣環境中生長和繁殖。因此,單獨形成生物膜的能力是E.faecalis抵抗根管治療頑固存活和引起根管內感染的重要致病機制之一。

    1.1.2入侵牙本質小管的能力

    E.faecalis對牙本質小管有較強的入侵能力,而傳統的根管沖洗液和根管封藥對根管內壁及牙本質小管的滲透性十分有限,對一些進入牙本質深層的E.faecalis鞭長莫及。Al-Ahmad等使用SEM觀察發現E.faecalis對牙本質小管的入侵深度可達244μm;此外,該研究還觀察到E.faecalis的菌細胞小于牙本質小管的孔徑,主要通細胞分裂入侵牙本質小管,入侵深度與E.faecalis的生存環境、牙本質小管口的開放狀態以及走向等因素有關。能夠入侵牙本質深層生存這項能力使得E.faecalis在根管中較其他細菌或微生物更具競爭優勢。

    1.1.3對常用根管消毒藥物的耐受能力

    根管消毒常用藥物如Ca(OH)2、氯己定(chlorhexidine,CHX)等對E.faecalis的殺菌及清除效果并不理想。E.faecalis對Ca(OH)2耐受的能力與細胞膜上的質子泵有關,當環境pH較高時,E.faecalis能夠通過質子泵維持細胞內環境的酸堿平衡。Lew等發現在根管預備后即刻以及Ca(OH)2封藥1周后的根管內E.faecalis始終是檢出率最高的堿性耐受菌之一。

    Barbosa-Ribeiro等研究20例根管治療術后根尖周炎患牙,發現在根管預備前、后以及Ca(OH)2與2%CHX凝膠聯合封藥30天后E.faecalis的檢出率均為最高。E.faecalis對常用根管消毒藥物的耐受能力使常規的根管治療難以將其徹底消滅清除,是其在根管內持續存留并引起牙髓根尖周組織感染的重要機制之一。

    1.2糞腸球菌的相關毒力因子

    1.2.1脂磷壁酸

    脂磷壁酸(lipoteichoic acids,LTA)是E.faecalis細胞壁的重要成分,是一種含有磷酸甘油殘基的兩性大分子,能經脂質部分黏附于紅細胞、上皮細胞和中性粒細胞等宿主細胞,具有較強的免疫原性。Zhang等研究表明,E.faecalisLTA能夠誘導根尖周來源的人牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)釋放白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6),白細胞介素-8(interleu-kin-8,IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumorr necrosisfactor-α,TNF-α),這些促炎因子可直接造成根尖周組織破壞,募集并活化巨噬細胞,增強、擴大機體固有免疫應答,加劇局部炎癥反應和組織損傷。

    E.faecalisLTA能經p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核轉錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路刺激巨噬細胞釋放促炎因子TNF-α,并能上調巨噬細胞中NOD樣受體家族3(NOD-like receptors,NLRP3)炎癥小體在轉錄和翻譯水平的表達,進而促進半胱天冬蛋白酶1和IL-1β的釋放,促進炎癥細胞聚集和根尖周骨質吸收,加劇根尖周病損和癥狀。此外,Tian等還證實了LTA可直接誘導人成骨細胞樣細胞MG63發生細胞凋亡,影響根尖周病變的愈合過程,被認為是E.faecalis引起牙髓根尖周病變的重要毒力因子。

    1.2.2莢膜

    莢膜位于E.faecalis細胞壁外圍,主要由多糖構成。Bachtiar等發現莢膜多糖2型的E.faecalis具有很強的形成生物膜的能力,可能有助于E.faecalis在根管內黏附、定殖和存留。莢膜多糖具有親水性,帶有負電荷,可通過靜電排斥力抑制吞噬細胞的殺菌活性。有研究發現中性粒細胞對不含莢膜編碼基因的E.faecalis突變株具有明顯的吞噬殺傷作用,而對含有莢膜編碼基因的E.faecalis野生株則未表現出吞噬殺傷活性,提示了E.faecalis的莢膜具抗吞噬能力,可能是其躲避宿主防御的機制之一。

    1.2.3腸球菌表面蛋白

    腸球菌表面蛋白(entero-coccal surface protein,ESP)是位于E.faecalis細胞壁表面的一種高分子量黏附蛋白,由位于E.faecalis毒力島(pathogenicity islands,PAIs)的esp基因編碼。Toledo-Arana等研究認為ESP在E.faeca-lis形成生物膜的過程中起到關鍵作用,能夠增加E.faecalis細胞表面疏水性,促進其初始黏附和形成生物膜。

    1.2.4明膠酶

    明膠酶(gelatinase,GelE)位于E.faecalis細胞膜,是金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成員之一,編碼基因gelE亦位于PAIs。GelE不僅能侵襲宿主細胞造成根尖周組織的破壞,還可促進生物膜的形成,有助于E.faecalis在根管中存留。

    1.2.5溶細胞素

    溶細胞素(cytolysin,Cyl)是外毒素,由多個位于PAIs的基因共同編碼,對宿主細胞有溶解破壞作用,并能抑制其他的革蘭氏陽性細菌的生長,被認為是E.faecalis的另一毒力因子。溶細胞性E.faecalis可產生Cyl,Lu等發現溶細胞性E.faecalis的IL-1β和MMP-8表達水平明顯高于非溶細胞性E.faecalis。然而也有學者對Cyl的致病作用提出質疑。Penas等從根管治療失敗患牙根管中分離得到21株E.faecalis,經PCR技術檢測發現其中無一表達cylB基因。Lins等在研究原發性根管感染病例時也取得同樣的結果。

    綜上E.faecalis致病機制可總結如下:①E.faecalis經牙體、牙周或其他途徑感染牙髓或根尖周組織,并進一步通過莢膜、ESP等自身結構物質黏附于宿主細胞表面,釋放毒性產物,誘導宿主局部免疫炎癥反應及組織損傷,引起患牙疼痛不適;②E.faecalis在根管系統內繁衍定植,進一步形成生物膜,并入侵牙本質小管,抵抗外界不良環境并頑固存留,使得常規治療手段難以將其徹底清除;③殘留于根管系統和牙本質小管中的E.faecalis伺機生長,其相關毒力因子不斷加劇局部炎癥反應和根尖周組織破壞,影響根尖周病變愈合。

    2.藥物對糞腸球菌的作用

    2.1次氯酸鈉

    次氯酸鈉(NaClO)是目前應用最廣泛的根管沖洗劑之一,其濃度、接觸作用時間會影響抗菌效果。研究表明5.25%NaClO對牙本質塊表面經3周孵育形成的E.faecalis生物膜有強大的殺菌作用,靜止接觸60s就能殺滅其中99.99%的E.faeca-lis。Wong等用0.5%NaClO進行傳統注射沖洗僅能在距根管腔內壁100μm的牙本質小管中對E.faecalis發揮良好的殺菌作用,平均殺菌率為78.9%,3%NaClO則能夠深入到200μm處殺滅77.6%的E.faecalis,而在更深層(200~500μm)的牙本質小管中0.5%NaClO和3%NaClO均無明顯抗菌作用。

    不同的根管沖洗方式對NaClO的抗菌效果也有一定影響。Mohmmed等用2.5%NaClO注射沖洗60s后,輔助使用超聲波設備蕩洗30s,能將根尖區E.faecalis生物膜清除率從43.67%提高到90.13%。此外,降低NaClO的表面張力可增強其對牙本質的浸潤和滲透能力,2%NaClO和表面活性劑氯堿聯用后可更好地清除根管內的E.faecalis生物膜。

    2.2氯己定

    氯己定(CHX)具有廣譜抗菌作用,被推薦作為NaClO的輔助或潛在替代品。CHX具有殘余抗菌效應,抗菌作用比較持久,但對有機和無機組織均無溶解作用。由CHX、乙二胺四乙酸、表面活性劑等混合制成的QMix是一種新型根管沖洗液,其對根管內的E.faecalis具有良好的抗菌性能。Bottcher等發現2%CHX溶液對牙本質有良好的親和力,能在7天內對牙本質塊表面的E.faecalis生物膜發揮持續穩定的殺菌作用。

    Lee等使用2%CHX凝膠對感染E.faecalis3周的人牙本質塊進行1周的診間封藥,結果表明2%CHX凝膠在200μm和400μm深度的牙本質中均能發揮良好的滲透殺菌能力。

    2.3氫氧化鈣

    Ca(OH)2糊劑是目前最常用的根管消毒藥物之一,不少研究表明E.faecalis對Ca(OH)2封藥有較強的耐受能力。雖然Stojanovic等通過臨床研究表明Ca(OH)2對慢性根尖周炎患者根管內的E.faecalis有良好的抗菌作用,Ca(OH)2糊劑封藥15d能完全清除機械化學預備后根管內殘留的E.faecalis。但是,Lee等的研究表明Ca(OH)2糊劑對牙本質的滲透能力有限,將Ca(OH)2糊劑置于感染E.faecalis3周的人牙本質塊表面進行1周的封藥處理,樣本檢測結果顯示在200μm深度的牙本質中E.faecalis生長未被抑制。此外,長期使用Ca(OH)2糊劑帶來的菌株耐藥性問題不容忽視。

    2.4抗生素類

    目前常見的根管內抗生素用藥主要有硝基咪唑類和四環素類藥物,近年來一些新型抗生素類藥物或以抗生素為主要抗菌成分的混合制劑被用于根管抗感染研究及治療。有學者使用含25wt%環丙沙星的聚合物支架材料對感染E.faecalis5d的人牙本質塊進行2d的處理后,在SEM下未見牙本質表面有E.faecalis殘留。

    三重抗生素糊劑(tripleantibioticpaste,TAP)是一種新型根管消毒藥物,主要成分為甲硝唑、環丙沙星和米諾環素,其對牙本質小管中的糞腸球有著強效且持續的殺菌作用。MTAD是一種由多西環素、檸檬酸和聚山梨醇酯-80混合而成的新型根管沖洗劑,能夠有效清除根管中的E.faecalis生物膜,作為終末沖洗劑使用時具有良好的抗菌性及去除玷污層的作用。然而抗生素的耐藥性問題仍然不容樂觀,其作為根管治療用藥的風險還需長期的療效觀察和評估。

    2.5抗菌肽

    由于傳統根管抗菌藥物NaClO、CHX及Ca(OH)2均具有一定的缺陷及不足,且抗生素類藥物的耐藥性問題日益顯著,其他一些具有抗菌性能的物質引起學者們的廣泛關注,抗菌肽就是其中之一。抗菌肽是一種內源性的生物分子,能通過靜電吸附作用破壞細胞膜完整性進而發揮殺菌作用。

    近年來有研究表明一些天然抗菌肽和人工合成抗菌肽對口腔致病菌具有廣譜抗菌性能。此外,大量研究表明抗菌肽具有良好的生物相容性及免疫調節作用,無顯著耐藥性問題,在根管治療領域有廣闊的開發和應用前景。Nisin是一種由乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis)合成的天然抗菌肽,單獨使用Nisin對感染E.faecalis3周的離體牙根管進行1周的診間封藥能夠清除根管內的E.faecalis,療效與Ca(OH)2相當。

    Nisin在與MTAD聯用時能夠取得更好的抗菌效果,但Nisin在根管治療方面的應用尚處于實驗研究階段。天然抗菌肽LL-37對E.faecalis浮游菌能夠發揮一定的生長抑制作用,效果好于Ca(OH)2,但起效濃度較高(MIC為256μg/mL)。人上皮源性的天然陽離子抗菌肽人β防御素-3(humanbeta-defen-sin-3,HBD3)對E.faecalis的MIC為2μg/mL,MBC為15.6μg/mL,HBD3凝膠(15.6μg/mL)在距根管腔內壁0~400μm的牙本質小管中發揮的抑菌效果顯著強于傳統根管封藥Ca(OH)2糊劑以及2%CHX凝膠。

    在此基礎上,Ahn等選取HBD3在C末端的15個氨基酸序列在體外合成了一種人工抗菌肽HBD3-C15,能有效抑制人牙本質塊表面E.fae-calis生物膜的形成,且能與Ca(OH)2和CHX發揮良好的協同抗菌作用。

    2.6其他

    天然植物有著廣譜抗菌活性,不易產生耐藥性問題。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocat-echin-3-gallate,EGCG)是綠茶中多酚物質的主要成分,具有抗菌、抗炎、抗氧化等活性。Lee等發現EGCG可能通過引起E.faecalis細胞內羥自由基產生而發揮殺菌作用,其對E.faecalis的MIC為5μg/mL,MBC為20μg/mL,500μg/mL的EGCG能夠清除E.faecalis生物膜。一些人工合成的物質也對E.faecalis有一定抗菌效果。Beyth等合成的季胺聚乙烯亞胺納米顆粒能在1h內殺滅E.faecalis浮游菌。

    Barreras等合成的殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles,CsNPs)與CHX對E.faecalis具有協同抗菌作用,兩者的混合物在較低濃度下(0.01%CHX-0.015%CsNPs)就能夠完全抑制E.fae-calis浮游菌的生長。還有研究表明羧甲基殼聚糖能對牙本質表面的E.faecalis生物膜發揮良好的殺菌作用。此外,Tay等發現一種金屬螯合劑對E.faecalis的MIC和MBC分別是2μg/mL和16μg/mL,牙本質粉末的存在對其抗菌效果無明顯的干擾。

    3.總結與展望

    近年來,E.faecalis作為持續性或繼發性根管感染的重要致病菌受到廣泛關注,相關研究也常將E.faecalis作為經典病原菌和藥物靶點用來探索致病機制和檢測抗菌治療效果。E.faecalis的一些致病能力和相關毒力因子使得其較其他細菌或微生物更具抵抗外界環境刺激和躲避宿主防御的優勢,也使得常規的根管治療難以將根管內的E.fae-calis徹底清除。

    隨著人們對牙髓根尖周病相關致病機制認識的豐富,以及抗菌治療藥物及新技術的不斷進展,大量研究將根管內E.faecalis的有效抑制、殺滅或清除作為重點。然而現階段與E.fae-calis相關的牙髓根尖周病致病機制及治療性研究大多停留在體外或離體研究層面,人們對E.faeca-lis真實致病過程和抗菌療效的深入了解還有待更多的體內實驗探究和驗證。

編輯: 陸美鳳

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